2.3. Малярийные комары как модельные объекты

популяционно-генетического анализа

Малярийные комары рода Anopheles (Diptera, Culicidae) являются удобными модельными объектами для экологического и популяционно-генетического анализа. В клетках слюнных желез личинок, трофоцитах и мальпигиевых сосудов имаго этих насекомых содержатся политенные хромосомы, которые характеризуются гигантскими размерами и хорошо расправляются при изготовлении препаратов [3]. Это дает возможность качественно анализировать их структуру и использовать как цитогенетическую маркерную систему для определения последствий воздействия на комаров абиотических и биотических факторов среды.

Методики приготовления препаратов политенных хромосом

Слюнные железы. Для цитогенетического анализа используются личинки комаров 4-го возраста, которые предварительно фиксируются спирт-уксусной смесью 3:1 (фиксатор Карнуа). Из грудного отдела на предметное стекло с каплей фиксатора извлекаются слюнные железы (рис. 5) и окрашиваются около 25 минут 2%-ым лактоацеторсеином. После чего излишки красителя удаляются, а железы раздавливаются под покровным стеклом в 45%-ой уксусной кислоте. При раздавливании необходимо слегка постукивать по покровному стеклу обратной стороной препаровальной иглы.

Рис. 5. Методика извлечения слюнных желез из личинок малярийных комаров при изготовлении цитогенетических препаратов.

а – общий вид личинки; б – локализация железы в грудном отделе (хитиновый покров надорван сверху и отведен в сторону); в – извлеченная железа; г, д – извлеченные парные железы; е – рыхлая структура желез (просматриваются отдельные клетки).

Стрелками указаны слюнные железы.

Мальпигиевые сосуды извлекаются из области 5 - 6 сегментов брюшка имаго в фиксаторе Карнуа (рис. 6). Мальпигиевые сосуды необходимо предварительно окрашивать 15-20 минут 2% ацеторсеином, и только затем 3-5 минут 2%-ым лактоацеторсеином.

Рис. 6.  Методика извлечения мальпигиевых сосудов из имаго малярийных комаров при изготовлении цитогенетических препаратов.

а – общий вид самки имаго; б – отчлененное брюшко; в – вскрытое брюшко в области 5 - 6 сегментов, где локализованы мальпигиевые сосуды (указаны стрелкой); г – извлеченные мальпигиевые сосуды.

Все изученные виды рода Anopheles характеризуются постоянным числом хромосом 2n=6. В кариотипах малярийных комаров обязательным является наличие 2-х пар длинных аутосом и одноплечей более короткой половой хромосомы, представленной левым плечом (XL) (правое плечо гетерохроматизировано и на препаратах почти не видно). Аутосомы имеют левое и правое плечи: 2L и 2R, 3L и 3R, соответственно (рис. 7, 8). Если принять общую длину хромосом кариотипа за 100%, то на первую половую хромосому будет приходиться около 8%, вторую равноплечую хромосому – 45,5% и третью хромосому – 46,5% (левое плечо – 16%, правое плечо – 30,5%).

Гомологи тесно сконьюгированы, а их центральные участки объединены по принципу эктопической коньюгации. Окрашенные хромосомы при рассмотрении в световой микроскоп имеют характерный дисковый рисунок, обусловленный тем, что хромомеры (области хромонем с высокой степенью спирализации) расположены строго друг возле друга. Необходимо отметить, что половая хромосома (XL) у самцов представлена одним гомеологом, поэтому на препаратах выглядит более тонкой и менее окрашенной, сохраняя при этом последовательность дисков.

В Западной Сибири обитает два вида-двойника этой группы, которые проще всего различаются именно цитогенетическим методом с использованием составленных для них карт хромосом (рис. 7, 8).

Рис. 7. Карта политенных хромосом Anopheles messeae, «стандарт»

(с любезного разрешения Стегния В.Н. [4])

Обозначения: XL – первая хромосома; 2R – правое плечо второй хромосомы; 2L – левое плечо второй хромосомы; 3R – правое плечо третьей хромосомы; 3L – левое плечо третьей хромосомы. Каждое плечо разбито на определенное число районов, пронумерованных цифрами.

Скобками указаны участки локализации широко распространённых по ареалу инверсий.

Изменение конфигурации хромосомы и взаиморасположения дисков свидетельствуют о наличии хромосомных перестроек. Основным типом хромосомных перестроек у малярийных комаров являются парацентрические (в пределах одного плеча) инверсии, обусловливающие генетический полиморфизм в популяциях на хромосомном уровне. Генетический полиморфизм – это одновременное нахождение в одной популяции двух и более генетических форм, частота которых выше, чем частота случайных мутаций.

Рис. 8. Карта политенных хромосом Anopheles beklemishevi

(с любезного разрешения Стегния В.Н. [4]).

Обозначения хромосомных плеч то же, что и на рисунке 7.

Скобкой указан участок локализации инверсии в половой хромосоме, часто встречающейся в популяциях.

Внутривидовой инверсионный полиморфизма у малярийных комаров имеет адаптивное значение.

A. messeae. Обнаружены пять широко распространенных по ареалу инверсий в гомо- и гетерозиготном состояниях, локализованных во всех трех хромосомах [4] (рис. 9). В настоящее время используются следующие обозначения хромосомных вариантов: индексом «₀» отмечены эволюционно исходные последовательности половой хромосомы и аутосом. Последовательность XL₀ имеет инвертированный район 2a - 5a; последовательность 3R₀ - инвертированный район 24a - 26c; последовательности 2R₀, 2L₀, 3L₀ совпадают с вариантами, принятыми за стандарт на приведенной карте хромосом A. messeae. Инверсии обозначены цифровыми индексами: XL₁ (стандартная XL на карте хромосом); XL₂ (1c - 4a); 2R₁ (7c - 12c); 3R₁ (стандартная 3R на карте хромосом); 3L₁ (сложная перестройка в районах 34a - 39d, состоящая из двух перекрывающихся инверсий).

Рис. 9. Распространенные хромосомные инверсии A. messeae в гомо- и гетерозиготных состояниях (с любезного разрешения Стегния В.Н. [4]).

I:  A – XL₂₂, B – XL₁₂, C – XL₁₁, D – XL₀₁, E – XL₀₀ (центромера справа); II: A – 2R₀₀, B – 2R₀₁, C – 2R₁₁ (центромера слева); III: A – 3L₀₀, B – 3L₀₁, C – схема 3L₀₁, D – 3L₁₁ (центромера справа); IV: A – 3R₁₁, B – 3R₀₁, C – 3R₀₀ (центромера справа).

Стрелками указаны инверсионные участки хромосом (точки разрывов смотри в тексте).